ISSN on-line: 2358-288X
Reprodução & Climatério Reprodução & Climatério
Reprod Clim 2013;28:92-103 - Vol. 28 Núm.3 DOI: 10.1016/j.recli.2012.12.002
Artigo original
Cultura de células da granulosa humanas com fenótipo de fase folicular: influência do sistema quimicamente definido na morfologia, ultraestrutura, secreção de esteroides e relaxina
Culture of human granulosa cells with follicular phase phenotype: influence of chemically defined system on morphology, ultrastructure, secretion of steroids and relaxin
Alessandra Aparecida Virequea, Jacira Ribeiro Camposa, Carolina Oliveira Camposa, Marcelo Picinin Bernucia, Maria Célia Jamurb, Rui Alberto Ferriania, Marcos Felipe Silva de Sáa, Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silvaa,,
a Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
b Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Recebido 19 Novembro 2012, Aceitaram 14 Dezembro 2012
Resumo

Está bem descrito na literatura o padrão de cultivo de células da granulosa (CG) humanas que perpetua a luteinização, simulando a fase lútea do ciclo. Nesse sistema, há redução na secreção de estradiol (E2) e aumento na síntese de progesterona (P4) e relaxina (RLN). Objetivamos padronizar um sistema de cultura livre de soro, com o intuito de reverter o processo de luteinização de CG obtidas em ciclos de fertilização in vitro (FIV), pré‐luteinizadas pela gonadotrofina coriônica humana (hCG), para aplicação na maturação in vitro de folículos ovarianos pré‐antrais. Foi feito estudo experimental com GC obtidas de 10 mulheres em tratamento de reprodução assistida. As CG foram cultivadas em α‐MEM contendo IGF‐I, ITS, androstenediona, PVP‐40 (meio quimicamente definido) ou TCM‐199 contendo FSH/soro. Após 48, 96 e 144 horas, foram avaliados: morfologia das culturas, produção de E2, P4 (Quimioluminescência/Immulite), RLN (Elisa) e ultraestrutura (Microscopia Eletrônica). Os dados foram analisados por Anova e regressão linear com efeitos mistos (SAS versão 9.0). Células cultivadas em α‐MEM apresentam alta capacidade estrogênica e padrão de produção hormonal característico da fase folicular, mantendo características morfológicas/ultraestruturais semelhantes a células in vivo. No sistema de cultura padronizado, as CG não completam in vitro o processo de luteinização deflagrado pela hCG, assumindo fenótipo de fase folicular.

Abstract

It is well described in the literature the granulosa cells (GC) culture pattern that perpetuates human luteinizing simulating the luteal phase of the cycle. In this system, there is a reduction in the secretion of estradiol (E2) and increased synthesis of progesterone (P4) and relaxin (RLN). We aim to standardize a serum‐free culture system, in order to reverse the luteinization process of GC obtained in IVF cycles, pre‐luteinized by hCG, for use in in vitro maturation of preantral ovarian follicles. An experimental study was conducted with GC obtained from 10 women undergoing treatment for assisted reproduction. The GC were cultured in α‐MEM containing IGF‐I, STI, androstenedione, PVP‐40 (chemically defined medium) or TCM‐199 containing FSH/serum. After 48, 96 and 144h were analyzed: culture morphology, concentrations of E2, P4 (Chemioluminescence/Immulite), and RLN (Elisa), and ultrastructure (Electron Microscopy). Data were analyzed by Anova and linear mixed‐effects regression (SAS version 9.0). Cells cultured in α‐MEM present estrogenic capacity and pattern of hormone production characteristic of the follicular phase, maintaining morphological/ultrastructural features similar that in vivo cell. In standard culture system, the CG not completes in vitro luteinization process triggered by hCG, assuming follicular phase phenotype.

Palavras‐chave
Células da granulosa, Sistema quimicamente definido, Luteinização, Ultraestrutura, Esteroides, Relaxina, Maturação in vitro, Técnicas de reprodução assistida
Keywords
Granulosa cells, Chemically defined system, Luteinization, Ultrastructure, Steroids, Relaxin, In vitro maturation, Assisted reproduction techniques
Reprod Clim 2013;28:92-103 - Vol. 28 Núm.3 DOI: 10.1016/j.recli.2012.12.002